测试片验证的菌株选择、数量与接种方案实操

一、引言

  在微生物测试片适用性验证中，菌株是试验的“标尺”，接种量与接种方案则是保证试验科学、可比、可重复的关键。依据GB 4789.45-2023《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》，菌株选择、菌液浓度控制、接种方式都有明确且严格的规定。本文从实操角度，系统说明如何规范完成菌株筛选、菌液制备与接种设计，为验证试验提供可直接执行的技术方案。

二、菌株的选择原则

  国标明确要求，验证所用菌株应具有典型性、代表性、溯源性，优先采用标准菌株、参考菌株或经鉴定的食品分离菌株，不得随意使用来源不明的菌株。具体选择时应满足以下要求。

  （1）目标菌必须覆盖。定性或定量测试片，必须采用对应项目的标准菌株，例如测试大肠菌群测试片应选用大肠菌群代表菌株，测试金黄色葡萄球菌则选用金黄色葡萄球菌标准菌株。

  （2）需包括近源干扰菌。为验证特异性，必须加入非目标菌但形态接近、生化相似的菌株，用于考察测试片是否出现假阳性或交叉反应。

  （3）包含食品实际分离株。标准菌株性状稳定，但食品分离株更贴近真实检测场景。国标鼓励在验证中加入一定比例的近期食品分离菌株，提高验证的实际意义。

  （4）菌株数量满足最低要求。GB 4789.45规定，包容性试验需要选择至少30株目标微生物，对于沙门氏菌检验方法的包容性试验，选择不同血清型的至少50株沙门氏菌，应涵盖主要沙门氏菌血清型。排他性试验至少选择30株非目标微生物。每个测试中纯培养物的接种量宜为102CFU～103CFU。

三、菌株数量与浓度控制

  无论是定性还是定量测试片，菌液浓度都必须精准可控。

  对于定量测试片（如菌落总数、霉菌酵母），接种浓度应控制在测试片线性范围以内，通常为10 CFU/ mL～100 CFU/ mL 级别，保证计数落在清晰可读区间，避免浓度过高导致菌落融合、浓度过低导致统计误差大。

  对于定性测试片（如致病菌测试片），需设置低、中、高三个接种水平：

  低浓度接近方法检出限，用于验证灵敏度；中浓度典型污染水平，用于日常条件模拟；高浓度模拟严重污染样品，考察在高菌量下是否仍能准确判读。

  菌液制备统一采用10倍梯度稀释法，使用磷酸盐缓冲液或生理盐水作为稀释液，每步稀释充分混匀，保证菌液均匀、稳定。同时，所有菌液必须同步用参考方法平板计数，以传统平板结果作为真实菌量参照。

四、接种方案设计

  依据国标，测试片验证接种分为两类：人工污染样品接种与纯菌株直接接种，二者缺一不可。

（1）纯菌株直接接种法。

  主要用于测试片基础性能评价，包括准确度、精密度、特异性。操作时，取已制备好的不同浓度菌液，直接接种在测试片中央，均匀覆盖反应区域，在规定条件下培养后观察结果。每个稀释度至少做3个平行，重复性试验需在同一天内完成，再现性可由不同人员、不同时间分别测试。该方案用于排除基质干扰，直接反映测试片本身对菌株的反应能力。

（2）人工污染食品样品接种法。

  这是适用性验证最关键、最贴近实际的部分。选择2～3种代表性食品基质，如高蛋白基质（肉制品）、高脂基质（油炸食品）、高糖基质（糕点）、酸性基质（果蔬）等。先对样品进行预处理，确认本底菌符合要求，再加入已知浓度的目标菌液，制成人工污染样品。

  接种时，测试片组与参考方法组使用同一份均质液，保证前处理完全一致。按照产品说明书与国标方法分别操作，在相同培养条件下同步培养，最终对比两组结果。国标要求，定量项目需满足对数差值在±0.5 log10范围内，定性项目需满足灵敏度、特异性符合规定。

五、注意事项

  在接种实操中，还需注意三个细节。一是严格无菌操作，防止环境杂菌污染影响结果；二是接种量一致，测试片与传统平板的接种体积尽量相同，减少系统误差；三是接种后及时培养，避免菌液在室温放置过久导致活菌数变化。

  最后，菌株与接种方案的记录与追溯同样是国标的重点。试验中必须记录：菌株编号、来源、传代次数、稀释方案、接种量、实际平板计数值、培养条件、平行样结果等。完整记录不仅是试验可信的保证，也是后续评审、核查、方法确认时的重要依据。

  综上，依据GB 4789.45开展测试片适用性验证，菌株选择要典型、足量、可追溯，菌液浓度要精准、梯度合理，接种方案要纯菌与基质结合、平行与对照齐全。只有把每一步实操做规范、做标准，才能获得真实、可靠、符合国标要求的验证数据，为测试片的合规使用提供坚实支撑。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

上一篇：筷子发霉处理建议

下一篇：没有了！